1.材料

1.1菌种

金黄色葡萄球菌ATCC、副干酪乳杆菌CGMCC（肽素公司）

1.2培养基

MRS培养基（改良MRS培养基基础）

成分：蛋白胨10.0g牛肉膏粉5.0g酵母膏粉4.0g

葡萄糖20.0g吐温-.0ml磷酸氢二钾2.0g

乙酸钠5.0g柠檬酸三铵2.0g琼脂15.0g

硫酸镁(MgSO4.7H2O)0.2g硫酸锰(MnSO4.4H2O)0.05g

蒸馏水mLpH6.2±0.2

MRS肉汤

成分：酪蛋白酶消化物10.0g牛肉膏粉10.0g酵母膏粉4.0g

柠檬酸三铵2.0乙酸钠5.0g

硫酸镁(MgSO4.7H2O)0.2g硫酸锰(MnSO4.4H2O)0.05g

磷酸氢二钾2.0g葡萄糖20.0g吐温-.08g

蒸馏水mLpH5.7±0.2

营养琼脂NA

成分：蛋白胨10.0g牛肉膏粉3.0g氯化钠5.0g

琼脂15.0g蒸馏水mL

pH7.3±0.2

营养肉汤NB

成分：蛋白胨10.0g牛肉浸粉3.0g氯化钠5.0g

蒸馏水mLpH7.2±0.2

半固体琼脂

成分：蛋白胨10.0g牛肉膏粉3.0g氯化钠5.0g

琼脂4.0g蒸馏水mLpH7.4±0.2

1.3主要仪器与设备

FAB电子分析天平上海佑科仪器仪表有限公司

DSX-B手提式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂

SW-CJ-1FD垂直净化工作台苏州博莱尔净化设备有限公司

SPX-生化培养箱上海申贤恒温设备厂

CRT可见分光光度计上海佑科仪器仪表有限公司

ZD-85A数显气浴恒温振荡器常州普天仪器制造有限公司

H2-16台式高速离心机湖南可成仪器设备有限公司

2方法

2.1预处理

2.1.1指示菌液的制备

病原菌扩培：挑取新鲜的斜面保藏病原菌1环，接种于mL无菌营养肉汤培养基中，摇床37℃，rpm，培养16-20h。

取培养好的病原菌悬液用无菌生理盐水稀释，可见光分光光度计检测吸光值，若OD在0.30-0.36之间，为有效病原菌悬液，病原菌含量约为cfu/mL。

2.1.2抑菌物质的制备

（1）0号样品：将副干酪乳杆菌CGMCC（图2.1）接种于MRS液体培养基中，37℃分别培养24H、48H，发酵液rpm离心20min，上清液直接加入牛津杯中作为实验用抑菌物质，沉淀物用1mL无菌水洗脱加入牛津杯中；

（2）1号样品：取10g01#培养物（培养五年以上，图2.2），加入mL无菌水，37℃分别培养24H、48H，发酵液rpm离心20min，上清液直接加入牛津杯中作为实验用抑菌物质，沉淀物用1mL无菌水洗脱加入牛津杯中；

（3）2号样品：取10g11#培养物（培养一个月以上，图2.3），加入mL无菌水，37℃分别培养24H、48H，发酵液rpm离心20min，上清液直接加入牛津杯中作为实验用抑菌物质，沉淀物用1mL无菌水洗脱加入牛津杯中；

（4）5号样品：诺氟沙星，国药准字H（图2.4），规格0.1g。取一颗诺氟沙星胶囊去除胶囊壳倒入50mL水中，震荡摇匀1H。

表2.1样品编号表

2.1.3双层平皿的制备

营养琼脂NA灭菌，45℃左右取15mL倒入平板凝固，干燥30min作为双层平皿下层；

将2.1.1中的病原菌悬液稀释至cfu/mL左右，每0.5mL稀释液加入4.5mL半固体琼脂培养基，倒入平皿均匀摊布，作为双层平皿上层。

2.2抑菌活性测定

选用牛津杯法对副干酪乳杆菌CGMCC2、01#培养物（培养五年以上）、11#培养物（培养一个月以上）24H及48H发酵液进行抑菌活性测定，根据抑菌圈直径大小来评价抑菌效果。实验所选用的指示菌为金黄色葡萄球菌ATCC。

将牛津杯放置于干燥好菌的双层平皿中。取μL抑菌物质滴加于牛津杯中。小心平稳地将平板放置于37℃培养箱中，静置培养16-20h，测定抑菌圈直径。

3.结果与分析

(1)副干酪乳杆菌CGMCC2抑菌作用（图3.1）：

24H发酵液离心上清液01a样抑菌圈直径约12mm10mm，具有中度抑菌作用；

24H发酵液离心沉淀物01b样抑菌圈直径约11mm10mm，具有中度抑菌作用；

48H发酵液离心上清液02a样抑菌圈直径约14mm10mm,具有中度抑菌作用；

48H发酵液离心沉淀物02b样抑菌圈直径约22mm15mm，具有高度抑菌作用。

24H发酵液离心上清液及离心沉淀物抑菌圈直径均小于48H发酵液离心上清液及离心沉淀物抑菌圈直径，说明发酵48H抑菌物质积累越多，抑菌效果越明显。证明副干酪乳杆菌CGMCC2长时间培养能产生并积累抑菌物质。

(2)01#培养物（培养五年以上）抑菌作用（图3.2）：

24H发酵液离心上清液11a样抑菌圈直径约20mm15mm，具有高度抑菌作用；

24H发酵液离心沉淀物11b样抑菌圈直径约18mm15mm，具有高度抑菌作用；

48H发酵液离心上清液12a样抑菌圈直径约20mm15mm,具有高度抑菌作用；

48H发酵液离心沉淀物12b样抑菌圈直径约23mm15mm，具有高度抑菌作用。

24H发酵液离心上清液及离心沉淀物抑菌圈直径略小于48H发酵液离心上清液及离心沉淀物抑菌圈直径，差异不显著。说明01#培养物（培养五年以上）抑菌物质含量稳定，抑菌效果显著。

(3)11#培养物（培养一个月以上）抑菌作用（图3.3）：

24H发酵液离心上清液21a样抑菌圈直径约11mm10mm，具有中度抑菌作用；

24H发酵液离心沉淀物21b样抑菌圈直径约12mm10mm，具有中度抑菌作用；48H发酵液离心上清液22a样抑菌圈直径约12mm10mm，具有中度抑菌作用；48H发酵液离心沉淀物22b样抑菌圈直径约13mm10mm，具有中度抑菌作用。

24H酵液离心上清液及离心沉淀物抑菌圈直径小于48H发酵液离心上清液及离心沉淀物抑菌圈直径，说明发酵48H抑菌物质积累更多，与01#培养物相比，抑菌物质积累量较少，需要更长的培养时间。

(4)诺氟沙星抑菌作用（图3.4），50样抑菌圈直径约22mm15mm，具有高度抑菌作用。

01#培养物（培养五年以上）与诺氟沙星的抑菌圈直径对比，差异不显著，具有同等抑菌效用。大约50g01#培养物（培养五年以上）中抑菌物质当量约等于0.1g诺氟沙星中抑菌物质当量。

表3.1植物乳酸菌培养物抑菌实验测定对比表

牛津杯抑菌实验标准：抑菌圈10mm为无抑菌作用，10mm抑菌圈15mm为中度抑菌，抑菌圈15mm为高度抑菌；

以下为各样品牛津杯抑菌实验培养皿图图3.1副干酪乳杆菌CGMCC2抑菌培养皿照片

注：01a,24H发酵液离心上清液的抑菌圈，01b,24H发酵液离心沉淀物的抑菌圈；02a,48H发酵液离心上清液的抑菌圈，02b,48H发酵液离心沉淀物的抑菌圈。

图3.#培养物（培养五年以上）抑菌培养皿照片

注：11a,24H发酵液离心上清液的抑菌圈，11b,24H发酵液离心沉淀物的抑菌圈；12a,48H发酵液离心上清液的抑菌圈，12b,48H发酵液离心沉淀物的抑菌圈。

图3.#培养物（培养一个月以上）抑菌培养皿照片

注：21a,24H发酵液离心上清液的抑菌圈，21b,24H发酵液离心沉淀物的抑菌圈；22a,48H发酵液离心上清液的抑菌圈，22b,48H发酵液离心沉淀物的抑菌圈。

图3.4诺氟沙星抑菌培养皿照片

4.结论

本公司植物乳酸菌(副干酪乳杆菌)培养物都含有抑菌物质，具有抑制有害菌菌作用。其中培养时间越长如五年以上培养物，抑菌物质积累越丰富。大约50g01#培养物（培养五年以上）中抑菌物质当量约等于0.1g诺氟沙星中抑菌物质当量。

本公司植物乳酸菌(副干酪乳杆菌)培养物中的抑菌物质不仅对金葡萄球菌ATCC有抑制作用，经研究，对其他有害菌如单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、沙门氏菌、宋内志贺氏菌、蜡样芽胞杆菌、大肠埃希式菌、铜绿假单胞杆菌具有同等抑制作用。